Endokrinní diagnostika reprodukčních poruch u koní

Interaktivní endokrinologický průvodce.

Autor: Agata Zagrajczuk, DVM, PhD

Navržen tak, aby pomohl odpovědět na následující otázky:

  • Co by se mělo testovat?
  • Kdy by se měly odebírat vzorky?
  • Jak by se měly interpretovat výsledky testů?

Rychlý průvodce pro výběr testu

Klinický problém Hormony Vzorek Kdy odebrat vzorky Užitečnost
Diagnostika nádoru z granulózních buněk Anti-Mülleriánský hormon (AMH) Sérum 0,5 ml V jakékoli fázi estrálního cyklu nebo březosti optimální
(stanovení je doporučeno)
Testosteron (T) Sérum 1 ml Koncentraci může ovlivnit fáze reprodukčního cyklu/březosti a sezónní faktory (podrobnosti naleznete v sekci s informacemi o testech) omezená – metoda je spolehlivá pouze v určitých případech*
Jiné poruchy ovariálních funkcí (anovulační cykly, neaktivita vaječníků, absence říjového chování) Estradiol (E2) Sérum 1 ml V závislosti na fázi reprodukčního cyklu nebo dysfunkci lze očekávat zvýšení nebo snížení koncentrace. posouzení fáze estrálního cyklu a aktivity vaječníků
Progesteron Sérum 0,5 ml V závislosti na fázi reprodukčního cyklu nebo dysfunkci lze očekávat zvýšení nebo snížení koncentrace. posouzení fáze estrálního cyklu a aktivity vaječníků
Potvrzení březosti
Problémy s udržením březosti
Progesteron Sérum 1 ml V závislosti na fázi cyklu nebo dysfunkci se očekává pokles nebo nárůst hladiny více než 15 dní po ovulaci včasná diagnostika březosti a hodnocení funkce žlutého tělíska
Sérový gonadotropin březích klisen (PMSG/eCG)
Surowica schłodzonaZchlazené sérum 1 ml
Mezi 40. a 120. dnem březosti potvrzení březosti
Estron sulfát (E1S)
Sérum 1 ml Od 80. dne březosti do přibližně jednoho týdne před porodem potvrzení březosti a posouzení funkce placenty*
Poměr DHP/Progesteron
(Luteo-placentární posun)
Sérum 1 ml Přibližně 100 až 120 dní březosti rozhodnutí o ukončení suplementace gestageny
Kryptorchismus / Poruchy funkce varlat Anti-Mülleriánský hormon (AMH) Sérum 0,5 ml Bez ohledu na denní dobu / roční období optimální
(stanovení je doporučeno)
Testosteron (T) Sérum 1 ml Nejnižší hodnoty ráno a mimo připouštěcí sezónu; nejvyšší hodnoty odpoledne a během připouštěcí sezóny omezená
hCG stimulační test u hřebců
(2x měření testosteronu)
Sérum (2x 1 ml) Dva vzorky krve odebrané s odstupem 1-2 hodin optimální
(doporučeno v případě nejasných výsledků AMH)

* Podrobnosti naleznete v popisech testů

Podezření na nádor z granulózních buněk

  • Anti-Mülleriánský hormon (AMH)
  • Testosteron (T)

Jiné ovariální dysfunkce

  • Estradiol (E2)
  • Progesteron

Posouzení březosti

  • Progesteron
  • Sérový gonadotropin březích klisen (PMSG/eCG)
  • Estron sulfát (E1S)
  • Poměr DHP/Progesteron
    (Luteo-placentární posun)

Testikulární dysfunkce / kryptorchismus

  • Anti-Mülleriánský hormon (AMH)
  • Testosteron (T)
  • hCG stimulační test u hřebců
    (2x měření testosteronu)

Rychlý průvodce pro výběr testu

Účel: Diagnostika nádoru z granulózních buněk (GCT) u klisen a kryptorchismu / zbytků testikulární tkáně u samců; vyhodnocení po kastraci ( )

Místo produkce / fyziologická role:
granulózní buňky ovariálních folikulů (malé folikuly; snížená produkce AMH ve velkých preovulačních folikulech)
Sertoliho buňky semenotvorných kanálků v varlatech

Čas na vyšetření:
absence říje nebo nepravidelné cykly (březost a normální cyklická aktivita nevylučují GCT)
změny chování od nymfomanie až po chování podobné hřebci, ale často bez viditelných změn
obvykle jeden výrazně zvětšený vaječník, druhý vaječník neaktivní (pozor, nádory mohou být oboustranné)
vyšší pravděpodobnost u klisen starších 10 let, i když se může vyskytnout v jakémkoli věku  
absence jednoho nebo obou varlat v šourku při současném chování podobném hřebci
plemenná predispozice ke kryptorchismu, zejména u amerického quarter horse a peršerona

Agresivní chování je často interpretováno jako známka nádoru z granulózních buněk nebo aktivní testikulární tkáně; studie však ukazují, že tato korelace je slabá. V takových případech poskytuje laboratorní diagnostika objektivní nástroj, užitečný zejména tehdy, když jsou výsledky zobrazovacích metod nebo palpace neprůkazné. 

Vzorek: serum 0,5 ml

Metoda: ELISA

Odběr vzorku: nezávislý na fázi estrálního cyklu

Interpretace
Zdravé klisny < 4 ng/ml
< 28,6 pmol/l
Klisny s GCT > 4 ng/ml
> 28,6 pmol/l
Hřebci – aktivní tkáň varlat > 0,27 ng/ml
> 1,9 pmol/l
Kryptorchismus / samci s dysfunkcí varlat < 0,27 ng/ml
< 1,9 pmol/l

Výhody: rychlý, rutinní test

Omezení: silná hemolýza – test bude zrušen, mírná hemolýza může způsobit zkreslení výsledků

Poznámka: Pokud jsou výsledky v rozporu s klinickým nálezem, doporučuje se test opakovat nebo potvrdit jinou metodou.

Histologický snímek vaječníku zdravé klisny. Foto: A. Zagrajczuk, DVM, PhD

Histopatologický snímek nádoru z granulózních buněk u klisny. Foto: S. Brunk, DVM, PhD

Histopatologický snímek nádoru z granulózních buněk u klisny. Foto: S. Brunk, DVM, PhD

Účel: Diagnostika kryptorchismu / zbytků tkáně varlat a posouzení funkce varlat u samců; vyšetření po kastraci; diagnostika nádoru z granulózních buněk (GCT) u klisen

Místo produkce:
buňky hilu vaječníku a thekální buňky folikulu
Leydigovy (intersticiálníbuňky ve varlatech

Čas na vyšetření
nepřítomnost jednoho nebo obou varlat v šourku při současném chování hřebců
plemenná predispozice ke kryptorchismuzejména u American Quarter Horse a Peršeron
nepřítomnost říje nebo nepravidelné cykly (březost a normální cyklická aktivita nevylučují GCT)
změny chování – zejména hřebčí chování (např. naskakování na jiné klisny), nymfomanie, což ukazuje na přítomnost thekální složky v GCT odpovědné za zvýšené koncentrace testosteronu
obvykle jeden výrazně zvětšený vaječník, druhý vaječník neaktivní (pozor, nádory mohou být oboustranné) 
obvykle u klisen starších 10 let, i když se může vyskytnout v jakémkoli věku

PoznámkaMěření testosteronu má smysl pouze v případech, kdy je přítomna thekální složka spojená se zvýšenými koncentracemi tohoto hormonu. Její přítomnost lze předpokládat v případech somatické maskulinizace (tj. zvýšená svalová hmota, hypertrofie klitorisu, výrazný hřebčí krk) a/nebo hřebčího chování, tj. naskakování na jiné klisny a flehmenova reakce v přítomnosti klisen v období říje.

Agresivní chování je často interpretováno jako známka nádoru z granulózních buněk nebo aktivní tkáně varlat; studie však ukazují, že tato korelace je slabá. V takových případech představuje laboratorní diagnostika objektivní nástroj, který je obzvláště užitečný v případech, kdy jsou nálezy ze zobrazovacích vyšetření nebo z palpace neprůkazné.

Vzorek: sérum 1 ml

Metoda: RIA

Odběr materiálu:
hřebců dochází k denním a sezónním výkyvům koncentrace 
klisen se koncentrace fyziologicky zvyšuje během říje

Interpretace
Hřebci/kryptorchismus – aktivní tkáň varlat > 0,13 ng/ml
> 130 pg/ml
Kryptorchismus / samci s dysfunkcí varlat < 0,13 ng/ml
< 130 pg/ml
Valaši < 0,06 ng/ml
< 60 pg/ml
Zdravé klisny < 0,06 ng/ml
< 60 pg/ml
Klisny s GCT > 0,06 ng/ml
> 60 pg/ml

Výhody: relativně nízké náklady na stanovení

Omezení: obtížná interpretace – výsledky testosteronu u hřebců mohou občas vykazovat falešně nízké hodnoty, a to jak v důsledku denních výkyvů hormonu, tak kvůli odběru vzorků mimo připouštěcí sezónu (např. v zimě). Je třeba také poznamenat, že pohlavní dospělost (kolem 2 let věku) se nerovná plné chovné dospělosti – hřebci dosahují maximální hormonální funkce varlat až ve věku 4-5 let, i když je toto načasování individuálně variabilní. Pokud tedy hormonální výsledky neodpovídají klinickému nálezu, doporučuje se test opakovat nebo použít hCG stimulační test, který umožňuje přesné posouzení kapacity varlat produkovat testosteron.

Poznámka: Pokud jsou výsledky v rozporu s klinickým nálezem, doporučuje se opakované testování nebo potvrzení jinou metodou.

Účel: Posouzení funkce varlat a diferenciální diagnostika mezi kryptorchismem a valachy

Čas na vyšetření
zlatý standard v případech neprůkazných výsledků bazálního testosteronu. Stimulační test má vyšší citlivost.

Indikace jsou stejné jako pro měření testosteronu, ale test je přesnější než stanovení bazálního testosteronu (T), protože poskytuje posouzení nárůstu T po stimulaci LH (hCG působí podobně jako LH a FSH, s převládající aktivitou podobnou LH). V důsledku toho významně (i když ne zcelasnižuje nejistotu spojenou s fyziologickými výkyvy koncentrací testosteronu.

Vzorek: sérum (2x 1 mL)

Metoda: RIA

Odběr materiálu:
Odebírají se dva vzorky krvePrvní (bazálnívzorek se odebírá před podáním hCGpoté následuje IV podání 5000-10000 IU hCG/koně a druhý vzorek krve se odebírá 1-2 hodiny po podání hCGVyšší koncentrace testosteronu lze pozorovat během připouštěcí sezóny.

Interpretace:
≥2 násobný nárůst ve srovnání s bazálním testosteronem indikuje přítomnost funkční tkáně varlat (hřebec nebo kryptorchismus)
Žádný významný nárůst indikuje valacha

Výhody: vyšší diagnostická přesnost než jednorázové (bazálníměření testosteronu

Omezení: možná opožděná reakce na hCG (po 120 minutách nebo později). Některé studie naznačují sníženou citlivost na hCG u hřebců mladších 18 měsíců a při testování v zimním období.

Účel: posouzení funkce žlutého tělískapotvrzení ovulacevyhodnocení fáze estrálního cyklu (říje vs. meziříjí), časná diagnostika březosti 

Místo produkce / fyziologická role:
žluté tělísko (CL) vaječníku

Čas testování
nepřítomnost říje nebo nepravidelné cykly 
přibližně do 45.-60. dne březosti při posuzování funkce CL nebo při rozhodování o suplementaci altrenogestem

Měření progesteronu se nedoporučuje ve střední a pozdní fázi březosti.

po 100-120 dnech březosti u klisen je udržení březosti podporováno placentárními progestogeny jinými než progesteron

Vzorek: serum 0,5 mL

Metoda: CLIA

Odběr materiálu: závisí na účelu testování; je třeba vzít v úvahu fázi cyklu nebo březosti

Interpretace:
3,2 nmol/l (1,00 ng/ml) endokrinně aktivní CL (meziříjí / březost / perzistentní CL)
≥ 12,8 nmol/l (4,00 ng/ml) koncentrace progesteronu považovaná za bezpečnou v časné březosti

Výhody: rychlýrutinní test

Omezení: obtížná interpretace – v časné březosti může docházet k výrazným výkyvům koncentrace progesteronu, které nemají diagnostický význam.

V případech rané embryonální mortality s perzistentním CL mohou koncentrace progesteronu stále indikovat březost. Výsledky by měly být vždy interpretovány ve spojení s ultrasonografickým nálezem.

Březost u klisny (23. den po ovulaci). Foto: A. Zagrajczuk, DVM, PhD

Post-mortem snímek vaječníku klisny po ovulaci. Foto: A. Zagrajczuk, DVM, PhD

Post-mortem snímek vaječníku klisny s aktivním, zralým žlutým tělískem.
Foto: A. Zagrajczuk, DVM, PhD

Účel: Posouzení fáze estrálního cyklu a aktivity vaječníků. Zvýšené hladiny jsou pozorovány u březích klisen po 60. dni březosti. Výrazný nárůst koncentrace může také indikovat přítomnost perzistentního anovulačního ovariálního folikulu. Během tiché říje (silent oestrus) mohou být koncentrace estradiolu nižší než hodnoty pozorované během normálního estrálního cyklu.

Místo produkce / fyziologická role:
vaječník – preovulační folikul

Čas na vyšetření:
nepřítomnost říje nebo nepravidelné estrální cykly

Vzorek: sérum 1 ml

Metoda: RIA

Odběr materiálu: závisí na účelu vyšetření – je třeba vzít v úvahu fázi estrálního cyklu nebo březosti.

Interpretace:
< 10 pg/ml – malé folikuly, odpovídající fázi meziříjí (dioestrus) / časné folikulární fázi / sezónnímu anestru
11-15 pg/ml – střední folikuly (průměr cca 20-30 mm), odpovídající folikulární fázi
> 15 pg/ml – velký folikul (průměr ≥ cca 30 mm; preovulační folikul), odpovídající říji
> 30 pg/ml – podezření na nádor z granulózních buněk nebo perzistentní anovulační folikul

Výhody: rutinní vyšetření pro detekci subklinické folikulární aktivity vaječníků. 

Omezení: Výsledky testu by měly být interpretovány ve spojení s ultrasonografickým nálezem. 

Ultrasonografický snímek vaječníku klisny s malými folikuly Foto: A. Zagrajczuk, DVM, PhD

Perzistentní anovulační folikul (PAF) – časná fáze luteinizace Foto: A. Zagrajczuk, DVM, PhD

Perzistentní anovulační folikul (PAF) – pokročilá fáze luteinizace. Foto: A. Zagrajczuk, DVM, PhD

Účel: potvrzení březosti mezi 40. a 120. dnem březostiNeplatí pro oslice

Místo produkce / fyziologická role:
Produkován v endometriálních pohárkách (endometrial cups) – strukturách fethálního původu vnořených do děložní sliznice klisny, které vznikají v důsledku invaze buněk trofoblastu (embryonální tkáně) do endometria v časné fázi březosti. Koňský chorionický gonadotropin (eCG) vykazuje aktivitu jak FSH (převážně), tak LH, což vede ke vzniku přídatných žlutých tělísek u klisen přibližně mezi 40. a 45. dnem březosti. Tento mechanismus zajišťuje udržení dostatečně vysokých koncentrací progesteronu nezbytných pro zachování březosti, dokud tuto funkci nepřevezmou placentární progestogeny, tj. kolem 100. až 120. dne březosti. Působení eCG může u březích klisen občas nepřímo vést i k projevům říjového chování, protože eCG stimuluje růst folikulů, což má za následek zvýšenou produkci estradiolu odpovědného za příznaky říje.

Čas na vyšetření
podezření/potvrzení březosti mezi 40. a 120. dnem březosti. V pozdějším stádiu dochází k regresi endometriálních pohárků.

Vzorek: sérum 1 ml (zchlazené)

Metoda: ELISA

Odběr materiálu: mezi 40. a 120. dnem po ovulaci

Interpretace: popisná

Výhody: rutinní test

Omezení: Možné falešně pozitivní výsledky – v případech odumření plodu, pokud nedojde k regresi endometriálních pohárků (perzistentní endometriální pohárky), mohou koncentrace eCG zůstat na úrovních indikujících březost. Byly hlášeny i případy perzistence endometriálních pohárků po 140. dni březosti; ty jsou však extrémně vzácné (cca 1-2 % klisen). 

Účel: Diagnostika březosti od 80. dne u klisen a od 120. dne u oslicVýsledky získané po 110. dni březosti u klisen jsou nejspolehlivější a klinicky nejužitečnějšíNavíc poskytují informace o životaschopnosti plodu a funkci placenty.

Místo produkce / fyziologická role:
Placenta – vzniká syntézou z DHEA produkovaného v plodových pohlavních žlázáchpřičemž sekrece se výrazně zvyšuje mezi 100. a 240. dnem březostipoté začíná klesat.
Placenta 
přeměňuje DHEA na „březostní“ estrogeny, převážně estron sulfát.

Čas na vyšetření
podezření/potvrzení pozdní březosti (od 80. dne po ovulaci)
podpůrně v případech: podezření na narušenou životaschopnost plodu nebo placentární insuficienci

Vzorek: sérum 1 ml

Metoda: RIA

Odběr materiálu: od 80. dne březosti (po ovulaci) do cca jednoho týdne před očekávaným termínem porodu

Interpretace:
Mezi 80. a 100. dnem po oplodnění indikují hodnoty >10 ng/ml březost.
Po 100. dni po oplodnění indikují hodnoty >100 ng/ml březost.
V případě negativního výsledku po 80. dni březosti je březost nepravděpodobná (citlivost testu 95-98 %).

Před jakýmkoli důležitým klinickým rozhodnutím se doporučuje provést klinické vyšetření.

Výhody: jeden z mála laboratorních parametrů, které jsou užitečné při posuzování stavu plodu a funkce placenty

Omezení: relativně dlouhá doba zpracování. Při posuzování funkce placenty a životaschopnosti plodu je náhlý, jasně diagnostický pokles koncentrace E1S detekovatelný až cca 2 dny před odumřením plodu/potratem.

Účel: určení časového bodu, kdy udržení březosti přebírají placentární progestogeny (luteo-placentární posun).

Místo produkce / fyziologická role:
progesteron – produkovaný žlutým tělískem (CL), odpovědný za udržení březosti přibližně do 100. dne.
DHP (5α-dihydroprogesteron) – hlavní progestogen produkovaný placentou s vysokou afinitou k progesteronovým receptorům a silnou biologickou aktivitou

Čas na vyšetření
Pro podporu rozhodnutí o ukončení suplementace altrenogestem (mezi 100. a 120. dnem březosti) bez rizika předčasného vysazení farmakoterapie.
Výsledek přesně indikuje zrání placenty.
Opakovaná měření DHP u stejné klisny poskytují dodatečné informace o normální funkci placenty v pokročilé fázi březosti.

Vzorek: sérum 1 ml

Metoda: LC–MS (kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií)

Odběr materiálu: mezi 100. a 120. dnem březosti

Interpretace:
U nebřezích klisen nebo během časné březosti je poměr 5α-DHP/progesteron <1. Po luteo-placentárním posunu, kolem 100.-120. dne březosti, je poměr 5α-DHP k progesteronu >1.

Výhody: vysoce přesný test.

Omezení: Jakožto potenciální marker zánětlivých stavů placenty by měl být hodnocen pomocí opakovaných měření a interpretován společně s dalšími parametry.

Podezření na nádor z granulózních buněk

  • Anti-Mülleriánský hormon (AMH)
  • Testosteron (T)

Jiné ovariální dysfunkce

  • Estradiol (E2)
  • Progesteron

Posouzení březosti

  • Progesteron
  • Sérový gonadotropin březích klisen (PMSG/eCG)
  • Estron sulfát (E1S)
  • Poměr DHP/Progesteron
    (Luteo-placentární posun)

Testikulární dysfunkce / kryptorchismus

  • Anti-Mülleriánský hormon (AMH)
  • Testosteron (T)
  • hCG stimulační test u hřebců
    (2x měření testosteronu)

Laboratorní diagnostika jednoduše