Čas na inovaci

Imunofenotypizace

metoda průtokové cytometrie dostupná pro klienty Veteo

Laboratoř Veteo ve spolupráci s týmem veterinárních onkologů a vědců představuje ve své nabídce imunofenotypizaci buněk metodou průtokové cytometrie.

Zakladatelem a správcem projektu je doktor Dariusz Jagielski.

„Na počátku mé práce s onkologickými pacienty, před téměř dvaceti lety, jsem se zajímal o imunofenotypizaci a průtokovou cytometrii a byl jsem okouzlen potenciálem této metody. Nakonec se nám podařilo shromáždit skupinu lidí, kteří nabízejí cytometrii jako standartní komerčně dostupné vyšetření pro pacienty s rakovinou krevetvorného systému. Základem úspěhu je kontakt s ošetřujícím lékařem – to vede k získání dalších užitečných klinických poznatků z cytometrického vyšetření.“

Náš tým

Náš tým tvoží kvalifikovaní pracovníci pod dohledem zkušené vedoucí, specialistky v oboru veterinární laboratorní diagnostiky- dr n. med. lek. wet. Marty Idziak.

Vedeckou oporu zajištuje dr. Aleksandra Pawlak z Fakulty veterinární medicíny Přírodovědné univerzity ve Vratislavi.

„Průtoková cytometrie je jednou ze základních vědeckých metod, které používám ve své práci. Cytometrická imunofenotypizace psích lymfomů a leukémií byla jednou z částí mé dizertační práce a od té doby jsem skutečným nadšencem této diagnostické metody, stále se rozvíjím v jejím používání. Komercializace vyšetření je podle mě vrcholem mé vědecké práce – protože věda by měla sloužit praxi!“

Nabízíme Vám možnost stanovit imunofenotyp rakovinných buněk lymfomu a leukémie u psů s použitím širokého panelu monoklonálních protilátek a specializovaného vybavení.

Zveme ke spolupráci všechny veterinární lékaře se zájmem o veterinární onkologii, kteří chtějí prohloubit hematoonkologickou diagnózu svých pacientů.

Jsme také otevřeni spolupráci s výzkumnými centry.

Průtoková cytometrie a indikace pro imunofenotypizaci

Průtoková cytometrie je běžně používanou metodou v laboratorní diagnostice. S jejím použitím, založeným na laserovém světelném skenování buněk, je možné přesně posoudit počet a morfologické vlastnosti buněk. Od počátku naší existence používáme ty nejmodernější průtokové cytometry ve veterinární sféře, které poskytují profesionální stanovení krevního obrazu u mnoha druhů zvířat.

V současné době jsme jedna z mála společností v Evropě, která je díky kombinaci technologie průtokové cytometrie, monoklonálních protilátek a fluorescence schopna provést pokročilé posouzení imunofenotypu buněk. Tímto testem zjišťujeme přítomnost diferenciačních antigenů (clusters of differentiation, CD), což umožňuje přesné určení typu buněk.

Ve veterinární medicíně se imunofenotypizace používá především v hematoonkologii.

Panel monoklonálních protilátek, které používáme:

CD45

marker leukocytů

CD34

marker kmenových buněk

CD3

marker T buněk (povrchový)

CD3c

marker T buněk (instracelulární)

CD4

pomocný marker T buněk

CD8

marker cytotoxických T buněk

CD5

marker T buněk

CD21

marker zralých B buněk (povrchový)

CD79alfa

marker B buněk (intracelulární)

Macrophages

marker monocytů/makrofágů

MHCII

marker hlavního histokompatibilního komplexu II (přítomný na lymfocytech a makrofázích)

Důležité upozornění

  • Pro testování imunofenotypu buněk pomocí průtokové cytometrie je vyžadována vysoká životaschopnost testovaných buněk. Z tohoto důvodu je nutné provést testování do 48-72 hodin od odběru biologického materiálu a pro transport je vhodné použít speciální médium (viz Pokyny pro přípravu transportního média).
  • Buněčný materiál by neměl být zmrazen ani fixován.
  • Vzorky pro cytometrické testy jsou přijímány od pondělí do čtvrtka (o víkendech a svátcích testování neprobíhá).
  • Léky, zejména cytostatika a glukokortikoidy, mají významný vliv na výsledek imunofenotypizace. Z tohoto důvodu se doporučuje provést testování před zahájením terapie.
  • Výsledky imunofenotypizace nelze interpretovat bez znalosti cytopatologického obrazu analyzovaného materiálu a klinických údajů o pacientovi. Z tohoto důvodu je nutné vyplnit online dotazník a zaslat čerstvé krevní nátěry na sklíčku a/nebo aktuální výsledky cytologického vyšetření.

Materiál k vyšetření

Materiálem pro testování imunofenotypu buněk průtokovou cytometrií může být jakýkoli kapalná suspenze živých buněk (periferní krev, kostní dřeň, tekutina z tělní dutiny). V případě biopsie z lymfatických uzlin nebo jiných pevných orgánů je nutné suspendovat buňky ve speciálním transportním médiu.

Pokyny pro přípravu transportního média

  1. Odeberte periferní krev od pacienta do zkumavky s EDTA.
  2. Vzorek krve zcentrifugujte, abyste získali krevní plazmu.
  3. Plazmu smíchejte s 0,9% roztokem NaCl v poměru 1:9. Jeden vzorek by měl mít objem asi 2 ml (0,2 ml plazmy + 1,8 ml roztoku NaCl).

Minimální celularita materiálu umožňující provedení testu je 3 miliony živých buněk. Objem vzorku, který má být zaslán k analýze, závisí na počtu buněk ve vyšetřované tkáni a je obtížné jej specifikovat. Obvykle jsou dostačující 2-3 vzorky u biopsie lymfatických uzlin, 2-3 ml periferní krve, 1-2 ml kostní dřeně.

Spolu s buněčným materiálem je vhodné poskytnout také krevní nátěry na sklíčku a/nebo aktuální výsledky cytologického vyšetření.

Dotazník pro lékaře objednávajícího vyšetření

Dotazník pro vyšetření

Zajímavé případy

Níže uvádíme krátké kazuistiky, které demonstují diagnostický potenciál imunofenotypového testování buněk psů průtokovou cytometrií.

Knírač s klinickým podezřením na lymfom

  • 10letý knírač s klinickým podezřením na lymfom potvrzeným cytopatologickým vyšetřením lymfatických uzlin.
  • Aby bylo možné posoudit klonalitu a původ neoplastických buněk, byl proveden test PARR, který překvapivě přinesl negativní výsledek (byly nalezeny znaky polyklonální proliferace z T a B lymfocytů jako při nenádorové stimulaci lymfatických uzlin).
  • Výsledky cytometrické analýzy ukázaly, že dominantní populací ve vyšetřované mízní uzlině byly středně velké až velké buňky s imunofenotypem CD45+ CD21+ CD79α+ MHC II+. Tento výsledek indikoval narušení fyziologických proporcí mezi T a B lymfocyty v mízní uzlině a jasně naznačoval nadměrnou proliferaci B lymfocytů*.

S přihlédnutím ke klinickým údajům a výsledkům cytologie lymfatických uzlin u pacienta umožnila imunofenotypizace rozptýlit pochybnosti o konečné diagnóze – byla nalezena přítomnost B-buněčného lymfomu a byla zahájena vhodná terapie.

*Pawlak A, et al. Immunophenotypic characterization of canine malignant lymphoma: a retrospective study of cases diagnosed in Poland Lower Silesia, over the period 2011–2013. Veterinary and Comparative Oncology, 2014, 14, 52–59.

 

Shih-tzu s příznaky generalizované lymfadenopatie a výraznou lymfocytózou v periferní krvi

  • 11letá fena shih-tzu s příznaky generalizované lymfadenopatie a výraznou lymfocytózou v periferní krvi přetrvávající asi rok
  • Histopatologické vyšetření extirpované submandibulární mízní uzliny provedené na začátku diagnostického procesu naznačilo její reaktivní hyperplazii, která nekorelovala s klinickým obrazem.
  • Výsledek imunofenotypizace indikoval ve vyšetřované uzlině přítomnost jasně dominantní populace buněk s imunofenotypem CD45- CD3+ CD8+ CD5+ MHC II+. Přítomnost velké populace buněk s fenotypem cytotoxických T lymfocytů bez exprese lymfocytárního markeru (CD45) svědčila o jejich neoplastické transformaci.

V tomto případě umožnila imunofenotypizace potvrdit přítomnost klinicky významného lymfomu a podle údajů z literatury navrhnout jeho podtyp jako lymfom T zóny (TZL).*

*Seelig DM, Avery P, et al. Canine T-zone lymphoma: unique immunophenotypic features, outcome, and population characteristics. J Vet Intern Med 2014; 28: 878-86.

 

Boxer s generalizovanou lymfadenopatií a cytologickým podezřením na lymfoblastický lymfom

  • 7letý boxer s generalizovanou lymfadenopatií a cytologickým podezřením na lymfoblastický lymfom
  • Cytometrická analýza umožnila identifikaci jasně dominatní populace buněk ve vyšetřovaných mízních uzlinách s fenotypem CD45+ CD3+ CD5+ CD4+, což odpovídá pomocným T lymfocytům. Díky imunofenotypizaci byla přítomnost lymfomu rychle a jednoznačně potvrzena, navíc byl jeho původ stanoven na T buňky. Podle literatury může fenotyp CD45+ CD4+ u lymfomů T buněk předvídat agresivní povahu a rychlou progresi rakovinného onemocnění* a boxeři jsou považováni za plemeno s vysokou predispozicí k tomuto typu neoplazie**.

 

*Avery PR, Burton JL, et al. Flow cytometric characterization and clinical outcome of CD4+ T-Cell Lymphoma in dogs: 67 cases. J Vet Intern Med 2014; 28: 538-546.
**Lurie DM, Milner RJ, et al. Immunophenotypic ad cytomorphologic subclassification of T-cell lymphoma in the boxer breed. Vet Immunology and Immunopathology 2008; 125: 102-110.

 

Kříženec v těžkém celkovém stavu se silnou leukocytózou a přítomností atypických buněk v nátěru periferní krve

  • 9letý kříženec v těžkém celkovém stavu se silnou leukocytózou, anémií, trombocytopenií a přítomností atypických buněk v nátěru periferní krve
  • V důsledku krevní cytometrické analýzy byla zaznamenána jasně dominatní populace kmenových buněk (CD34+) se současnou expresí markeru B lymfocytů (CD79α+).
    Fenotypované buňky neexpirmovaly markery CD14 a CD4, což umožnilo s vysokou pravděpodobností vyloučení linie myelomonocytární hyperplazie. V tomto případě byla imunofenotypizace základem pro konečnou diagnózu akutní lymfoblastické leukémie typu B (ALL-B)*.

 

* Vernau W, Moore PF. An immunophenotypic study of canine leukemias and preliminary assessment of clonality by polymerase chain reaction. Vet Immunol Immunopathol 1999; 69: 145-164.

 

Miniaturní knírač nevykazující žádné klinické příznaky s výraznou lymfocytózou přetrvávající několik měsíců

  • 15letý miniaturní knírač nevykazující žádné klinické příznaky s výraznou lymfocytózou přetrvávající několik měsíců bez přítomnosti atypických buněk v periferní krvi
  • V cytometrické analýze krve dominovala populace buněk s fenotypem CD45+ CD21+ CD79α+ MHC II+, což odpovídá lymfocytům B. Současně nedostatek exprese markeru kmenových buněk (CD34) vyšetřovaných buněk vyloučil přítomnost akutní lymfoblastické leukémie. Výsledek testu imunofenotypizace v tomto případě (v kontextu klinických údajů a výsledku nátěru periferní krve) umožnil zvážit přítomnost chronické lymfocytární leukémie B buněk (CLL-B) nebo případně lymfom malých B buněk (SLL-B) s postižením krve*.

*Comazzi S, Gelain ME, Martini V. Immunophenotype Predicts Survival Time in Dogs with Chronic Lymphocytic Leukemia. JVIM 2011: 25; 100-106.